Лаборатория микробиологии

Заведующий лабораторией с.н.с., к.б.н. Волошина Александра Дмитриевна

м.н.с. Сапунова Анастасия Сергеевна

м.н.с. Любина Анна Павловна
м.н.с. Амерханова Сюмбеля Камилевна

В рамках гранта РНФ №14-5000014 «Формирование на базе Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН международного научно-инновационного Центра нейрохимии и фармакологии», направления №3 «Создание новых антимикробных агентов» за период 2016-2018г. была создана и оснащена новым современным оборудованием лаборатория микробиологии на базе ИОФХ им. А.Е. Арбузова – обособленного структурного подразделения ФИЦ КазНЦ РАН.

Лаборатория микробиологии ИОФХ им. А.Е. Арбузова – обособленного структурного подразделения ФИЦ КазНЦ РАН 28.12.2018г. получила лицензию на деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III и IV степеней потенциальной опасности в соответствии с СП 1.3.2322-08.

За период 2016 - 2018г. лаборатория микробиологии была оснащена следующим вспомогательным и исследовательским оборудованием для микробиологических испытаний:

1. Ламинарные боксы 2 класса безопасности
2. Автоклавы (в том числе программируемый стерилизатор медицинский HG-50 производитель HIRAYAMA (Япония)) необходимые для стерилизации питательных сред, растворов, инструментов и спецодежды в лаборатории микробиологии.
3. Термостаты суховоздушные и шейкер инкубатор для культивирования микроорганизмов.
4. Фотометр для микропланшетов INVITROLOGIC (Россия), для постановки антимикробной активности в микроконцентрациях, проведения иммуноферментных анализов .
5. Aнализатор-амплификатор Light Cycler 96, фирма производитель: Roche, Франция

В лаборатории микробиологии при финансовой поддержке гранта РНФ №14-5000014 было создано новое направление по изучению цитотоксических и противоопухолевых свойств химических соединений на нормальных и опухолевых клеточных линиях человека. Закуплено вспомогательное оборудование и исследовательское оборудование, необходимое для работы с культурами клеток:

1. Инвертированный микроскоп Nicon TS 100
2. Многофункциональная система Cytell Cell Imaging (клеточный анализатор)
3. Система проточной цитофлуориметрии guava easyCyte
4. СО2-инкубаторы 8000WJ
5. Низкотемпературный холодильник - 902
6. Криохранилище для хранения клеточных культур.

В лаборатории создана коллекция клеточных культур, состоящая из восьми опухолевых и двух нормальных линий человека.

В лаборатории микробиологии активно проводятся испытания по определению антимикробного действия химических соединений методом серийных разведений и методом микроразведений (для прозрачных растворов) на ридере INVITROLOGIC в отношении чувствительных и резистентных штаммов микроорганизмов, также на клинических изолятах бактерий, выделенных из организма больных.
На анализаторе-амплификаторе Light Cycler 96 проводятся молекулярно-генетические исследования воздействия химических агентов на микроорганизмы. Изучаются механизмы выработки резистентности микроорганизмов к известным антимикробным средствам и новым потенциальным синтетическим антимикробным агентам.

Для изучения цитотоксичности и противоопухолевой активности исследуемых соединений применятся два метода:

1. Оценка цитотоксичности и противоопухолевой активности производится путем подсчета жизнеспособных клеток культуры, по сравнению с контролем при помощи многофункциональной системы Cytell Cell Imaging (GE Helthcare Life Science, Швеция), используя приложения Quick Count BioApp и Cytell Cell Viability BioApp. Приложение Quick Count BioApp позволяет точно подсчитать количество клеток и оценить их жизнеспособность на основании интенсивности флуоресценции с использованием одноразового гемоцитомера. Приложение Cytell Cell Viability BioApp обеспечивает проведение двух- или трех-цветного анализа в многолуночном формате с разделением на подгруппы для определения доли живых, мертвых и нездоровых клеток. Кроме оценки жизнеспособности клеточных культур многофункциональная систем Cytell Cell Imaging позволяет исследовать механизм действия новых потенциальных противоопухолевых агентов на молекулярном уровне. Приложения Cell Cycle BioApp и Apoptosis BioApp позволят изучить влияние исследуемых соединений на фазы клеточный цикла и индукцию апоптоза.
2. МТТ - колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевые красители (МТТ) - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид и (WST-8) - (2-(2-метокси-4-нитропентил)-3-(4-нитропентил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолиум) до формазана, который в первом случае имеет пурпурное окрашивание, во втором желтое. Для исследований планируется использованиеWST-8, так как он имеет преимущества перед МТТ в том, что восстанавливается вне клеток, соединяясь с медиатором электронов PMS, и формирует водорастворимый формазан WST-тесты могут быть прочитаны сразу же (в отличие от MTT-тестов, которые требуют стадию растворения), дают более эффективный сигнал, чем MTT, и уменьшают токсичность для клеток (в отличие от проницаемого для клеток MTT, и его нерастворимого формазана, который накапливается внутри клеток.

МТТ и WST- тесты применяется для измерения цитотоксичности (потери живых клеток) или цитостатической активности (сдвиг от пролиферации к состоянию покоя) потенциальных лекарственных агентов и токсичных веществ.

Проводятся исследования по выявлению методом проточной цитофлуориметрии влияния исследуемых биологически активных веществ на такие принципиально важные параметры как распределение популяции по фазам клеточного цикла, апоптоз, экспрессии внутриклеточных маркеров – т.е. уточнение механизма действия исследуемого соединения на уровне единицы популяции (к примеру, иммунотоксичные и мутагенные свойства).

Освоены методы лазерной конфокальной, просвечивающей электронной микроскопии и двумерного фореза.

В процессе работы по гранту РНФ №14-5000014 сотрудники лаборатории прошли курсы повышения квалификации по базовой специальности (микробиология), по работе с клеточными культурами на базе Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).

Все сотрудники лаборатории, включая молодых специалистов (студенты магистры) освоили новые современные методы исследования с использованием оборудования приобретенного на средства гранта РНФ №14-5000014.